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药物前沿
引言
灌流培养是哺乳动物细胞培养的重要工艺,主要通过培养液的动态更新来收集产物、移除废物、补充新鲜营养物质以确保细胞活力和蛋白的稳定表达。灌流工艺的不断优化，是生物医药企业降本增效的法宝之一。今天，多禧生物内容团队为各位读者介绍一篇阐述哺乳动物细胞灌流工艺优化准则的经典文章，让我们一同温故知新。
1.简介
哺乳动物细胞培养灌流工艺的形式如图1所示：通过不断加入新的培养基，流出旧的培养基（经过细胞截留装置）来实现反应器内培养基的更新换代，代谢产物及废物的有效去除，维持一定的细胞密度及活率，实现较高的体积产率。细胞培养灌流工艺一般通过细胞密度电极在线监测细胞密度，通过如下公式计算细胞弃置速率（CDR），通过调节CDR控制细胞密度，如图2所示。细胞截留装置主要包括微米级的中空纤维膜、超声截留等。
式1
图1
图2
特定的哺乳动物细胞培养是否适合灌流工艺可通过以下几个方面进行考虑：
（1）该细胞所产蛋白是否稳定，是否容易降解。（2）该细胞表达蛋白的阶段是否与细胞生长相关。（3）公司具体设备、经验等（4）经济性细胞比罐流速率（CSPR）是罐流工艺中的一个重要参数，是生物反应器中每个细胞每天获得的新鲜培养基的量，可通过如下公式计算。CSPR的变化范围很广，通常在0.05-0.5nL/cell/day。理论上来说，以CSPR为标准的灌流策略为细胞生长提供了一个相同且稳定的环境。当然，以相关的营养物质（如葡萄糖）为标准的灌流策略同样也是可行的。
式2
缩略词
μ：表观比生长速率（1/day）
V：反应器体积（L）
X：生物反应器内细胞密度（cells/mL）
XH：收获管内细胞密度（cells/mL）
CDR：细胞弃置速率（L/day）
CSPR：细胞比灌流速率（nL/cell/day）
D：罐流速率（反应器体积/天）
RT：停留时间（h）
OP：操作点
VP：体积产率（mg/L/day）
SGR：比生长速率（1/day）
QP：比产率（pg/cell/day）
t：时间
2.哺乳动物细胞灌流工艺的4个限制因素
（1）特定细胞所产蛋白的稳定性决定了该蛋白在反应器内的最长停留时间（RTmax）。最长停留时间决定了灌流工艺中所能采用的最小灌流速率（Dmin=1/RTmax）。不同蛋白的稳定性差异很大，如图3所示，蛋白1的半衰期只有5h，另一个蛋白在50h后仍旧十分稳定。显而易见，这两个蛋白需要采用不同的灌流策略。不同CSPR灌流工艺的条件下所产蛋白的浓度和质量稳定性值得进行研究。图3
（2）最大的灌流速率（Dmax）。一般来说，细胞截留设备的最大体积流量决定了Dmax，同时也是继续提升灌流速率的瓶颈。（3）最大细胞密度（Xmax）。特定生物反应器的氧气传递速率（OTR）决定了Xmax的大小。特定反应器的构造（如搅拌方式、通气方式等）、特定细胞系的特征（氧消耗速率OUR、剪切力的敏感程度等）均与特定工艺OTR的大小有关。（4）最小的细胞比灌流速率（CSPRmin）。特定细胞系的最低营养需求和特定培养基的成分共同决定了CSPRmin。通过培养基组成的优化可以逐步降低特定细胞系的CSPRmin，解除CSPRmin的限制。在细胞系、反应器构造以及培养基确定的情况下，Dmin、Dmax、Xmax、CSPRmin共同决定了灌流工艺的优化空间，如下图。
图43.灌流工艺优化实验的类型
灌流工艺优化实验：自变量：细胞密度（X）和灌流速率（D）；因变量：停留时间（RT）和细胞比灌流速率（CSPR）。RT与特定蛋白的降解速率直接相关，不稳定的蛋白需在低RT的条件下进行优化；CSPR反映了新鲜培养基的更新速率。灌流工艺优化实验可分为以下4种类型，如表1所示。
表1
类型1：最简单的类型，所有变量均保持稳定，为细胞及产品提供一个稳定的环境。此类型实验X、D、CSPR、RT均处于最优水平，适用于评价工艺的长期稳定性。见图5a。类型2：固定D和RT，通过改变X来改变CSPR，见图5b，优化范围一般为Xmax/10~Xmax。比如Xmax是50×cells/mL，则Xmin为5×cells/mL，假设D固定在2.5volumes/day（RT=9.6h），CSPR的变动范围为0.05nL/cell/day~0.5nL/cell/day。此类型实验可以看出CSPR对于比产率和比生长速率的影响，包括判定该工艺产蛋白阶段是否与细胞生长有关。类型3：此类型实验适用于不稳定蛋白，可以精确评估RT的影响。通过同时改变X、D保持CSPR不变，评估RT（RT一般变动范围2~24h）的改变对于比产率和产品质量的影响，见图5c。类型4：此类型实验不把RT作为影响因素，应用于稳定蛋白。通过改变细胞弃置速率（CDR）使X稳定在一个设定值，然后改变D来评估不同CSPR的影响，见图5d。此类型实验的优势是操作简单方便。假如将细胞密度维持在20×cells/mL，D的变动范围为1~10volumes/day，则CSPR变动范围为0.05~0.5nL/cell/day。图5
4.“Push-to-low”优化途径“Push-to-low”指的是通过逐渐降低灌流工艺的CSPR值来找到该工艺最优的CSPR值，优化采用类型2或类型4的实验。尽量小的CSPR值能够节省灌流工艺培养基的用量、提高体积产率（VP）、提升细胞密度，减少下游纯化的压力和成本。“Push-to-low”优化途径可以分为若干步，逐步降低D或提高X使得CSPR逐步降低，每一次CSPR的改变灌流工艺都会达到一个新的稳态，如图6/图7所示，最后找到可接受的最低CSPR值。每一个稳态期间监测过程参数（pH、渗透压等）、培养基组成（氨基酸组成、葡萄糖等）和比代谢速率（比生长速率、比葡萄糖消耗速率、比产物生成率等）来尝试找到可能的限制因素。其中培养基成分的优化可以去除某些限制因素。图6
图7
5.“Push-to-low”准则的应用细胞株：杂交瘤细胞，所产抗体稳定，RT是该细胞灌流工艺优化不需要考虑的问题。图8
图9生物反应器：15L，搅拌转速80rpm，pH6.8（0.3M氢氧化钠和CO2自动控制），接种密度1.0×cells/mL，稳态时细胞密度维持在20×cells/mL。如图8所示，该灌流工艺通过改变细胞弃置速率(CDR)将细胞密度稳定在20×cells/mL。通过改变灌流速率(6-4-3-2-1.3volumes/day)使CSPR逐步降低(0.3-0.2-0.15-0.1-0.07nL/cell/day)，与此同时，RT由3h提升到17h，见图9。当CSPR为0.07nl/cell/day时，细胞活率开始下降，其余的条件细胞活率未明显变化。灌流工艺优化过程中，关键营养物质葡萄糖、谷氨酰胺和关键代谢产物乳酸、氨离子浓度的测量是十分必要的，结果如图10所示。不同CSPR，葡萄糖浓度在1.2g~3.0g/L之间，乳酸浓度在0.5~1.0g/L，均未形成底物及代谢产物抑制。谷氨酰胺浓度在1.0~4.0mM之间，氨离子浓度在4.0~6.0mM之间，未形成底物或代谢产物抑制。图10
不同CSPR条件下的氨基酸浓度如图11所示，除了天冬酰胺和色氨酸，其余所有的氨基酸都在初始浓度的20%以上。天冬酰胺和色氨酸在CSPR0.07nL/cell/day的条件下耗尽。除此之外，一些未知的有毒代谢产物也可能是细胞活率下降的原因。图11
在较低的CSPR条件下实现稳定的细胞密度，较好的细胞比生长速率对于灌流工艺是十分有利的。在CSPR0.07nL/cell/day的条件下，SGR已接近0，见图12a。在低CSPR的条件下，凋亡细胞的比例明显增多，见图12b。筛选对凋亡有抑制的细胞株、使用抑制细胞凋亡的培养基添加剂在一定程度下能降低细胞凋亡的比例。图12
“Push-to-low”优化准则能否成功取决于特定细胞株的产蛋白动力学。如果细胞株所产蛋白的QP随着CSPR下降而下降，那么随着CSPR的下降，该工艺的VP也会下降。由图13a可知，不同的CSPR带来的细胞培养环境的改变并没有影响该细胞株的QP，这对于“Push-to-low”的优化准则是十分有利的。由图13b可知，由于细胞密度维持在20×cells/mL，CSPR的改变同样不会影响VP的值。CSPR越小，收获的培养基中的蛋白产量越高，CSPR在0.07nL/cell/day时，收获液中的蛋白产量比初始灌流工艺提高了%。培养基使用量减少，节约了成本。图13
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参考资料：AdvBiochemEngin/Biotechnol（）：75-98免责声明：多禧生物内容团队旨在带读者了解ADC产学研最新进展。本文仅作学习交流之目的，因此并不能代表多禧生物的立场和观点。同时，本文也非治疗方案推荐，如需获得治疗方案指导，请遵医嘱。版权说明：本文由多禧生物内容团队编写，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。如需申请转载，请在
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